Bağlama (biyoloji)
Bağlama veya ligasyon, rekombinant DNA teknolojisinde klonlanacak geni taşıyan DNA parçaları ile vektörün bir enzim aracığılıyla birbirlerine bağlanması işlemine denir. Bu işlem için ligaz cinsi enzimler görev yapar.
Bağlamadaki sorunlardan biri vektörün yabancı DNA'ya bağlanması yerine kendi uçlarının birleşip halka şeklini kazanmasıdır, bunu engellemek için yapılan uygulamalardan biri, vektörün 5' uçlarındaki fosfat gruplarının yokedilerek fosfodiester bağ oluşumunu önlemektir.
Bağlama için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir. Değişik yöntemlerle bu gerçekleştirilebilir:
- Kesme enzimleri tarafından meydana getirilen yapışkan uçların birbirini tanıması şeklinde bağlanma
Aynı cins enzimle kesilmiş DNA parçaları ve doğrusal konuma getirilmiş taşıyıcı DNA molekülleri bir araya getirildiğinde, farklı kökenlere sahip olsalar bile, birbirlerini tamamlayıcı özellikteki (yapışkan) uçları taşımalarından dolayı uçlar arasındaki baz eşleşmeleriyle moleküller bağlanır. Sonrasında ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları kurarak açık uçları kapatır.
Bu yöntem rDNA elde etmek için kullanılan en basit ve etkili yoldur. Ligaz yüksek yoğunlukta kullanılırsa rekombinant oranı artarken, düşük yoğunlukta kullanıldığında DNA parçaları halka şeklini alırlar.
- Bağlayıcı ya da aracı moleküller kullanarak bağlanma
Bu yöntem küt olan uçların bağlanmasında kullanılır. Aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır. Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşan oligonükleotidlerdir. Bu moleküller 5' uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlu parçalara bağlanır ve bir kesme enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur. Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligazla kapatılmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır.
- Homopolimerik tek zincirli kuyruklar kullanarak bağlanma
Bu yöntemle de küt uçların bağlanması sağlanmaktadır. Küt uçların 3' uçlarında terminal transferaz enzimi yardımıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar takılır. Bu yöntem özellikle ökaryotik genlerin çoğaltılmasında kullanılmaktadır. Ökaryotik cDNA parçalarının taşıyıcılara bağlanmasında kuyruklama yöntemi başarılı sonuçlar vermektedir.
Ayrıca bakınız
Kaynakça
- Genetik Mühendisliği, Prof. Dr. Güler TEMİZKAN