SDS-PAGE: Revizyonlar arasındaki fark

İçerik silindi İçerik eklendi

Satır içi

Sayfanın 08.57, 12 Nisan 2018 tarihindeki hâli

SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel Elektroforez) bir poliakrilamid jel elektroforez varyantı olan ve biyokimyada karışımlardaki yüklü molekülleri elektrik alan varlığında moleküler kütlelerine göre ayıran bir analitik metod. Sodyum dedesil sülfat (SDS) molekülleri proteinlerin izolasyon ve tanımlanmasına yardım ederler.

Bu süreksiz elektroforetik sistemi Ulrich K. Laemmli tarafından geliştirilmiştir. Bu teknik molekül kütlesi 5 ve 250 KDa arasında arasında olan proteinleri iyi ayırır .^[1] Bu metodu açıklayan makale, tek kişi tarafından yazılmış en çok atıf almış makale iken totalde is ikinci en çok atıf almış makaledir.^[2]

Özellikleri

SDS-PAGEproteinlerin moleküler kütlerlerine göre ayrımına izin veren bir yöntemdir. Aynı zamanda matrix olarak bilinen medyum poliakrilamid temelli devamsız bir jeldir. Buna ek olarak, SDS kullanılır. Yaklaşık 1.4 gram SDS 1 gram proteine bağlanır^[3]^[4]^[5] , yani her bir aminoasite 2 SDS molekülü bağlanmış olur. SDS yüzey aktif madde olarak davranır, proteinlerin kendi taşıdıkları yüklerin üzerini kaplar ve böylece proteinlerin kendi yükleri kaybolmuş ve ayrım yük temelinde gerçekleşmemiş olur. Ayrıca pozitif yükler de ayırma jelinin bazik pH' ı ile yüksek oranda indirgenir.Belli bir elektrik alanın varlığında proteinler anottan katoda doğru ilerler bu ilerlemenin hızı moleküler kütlenin büyüklüğü ile değişir. Bu basit prosedür proteinlerin moleküler kütle temelinde hassas ayrımına olanak sağlar.

Prosedür

SDS-PAGE metodu jelin hazırlanması, numunenin hazırlanması, elektroforez, protein boyama veya western blot ve oluşan bantların incelenmesinden ibarettir.

Jel üretimi

Tarağı (beyaz renk) kaldırmadan önceki polimerize olmuş sıkışma ve ayırma jeli. Sıkışma jelinde küçük bir miktar bromofenol mavisi vardır. Bu boya gözlem yapmayı kolaylaştırır. Ayırma jeli ise boyanmamıştır.

Jel, readikal polimerizasyonu ile birbirine mühürlü iki cam parçasından oluşan kalıbın içinde oluşur. Bu iki cam parçası maşalar yardımı ile geçici olarak mühürlenir. Jel solusyonu monomer olan acrilamid, çapraz bağlardan sorumlu metilenbisacrilamid, yarılma ve sıkışma tamponları, su ve SDS' ten ibarettir. TEMED katalizörü ve başlatıcı amonyum persülfat (APS) ortama eklemek polimerizasyonu başlatır.

Numune hazırlama

Numune hazırlamada, numune tamponu ve SDS çok miktarda numuneye uygulandıktan sonra numune 95 °C' de 5 dakika ısıtılır. Bu işlemler hidrojen bağlarını yıkarak 2. ve 3. yapıları bozar. Posiyonel olarak disülfid bağları indirginme ile kırılabilir. Bu amaçla, β-merkaptoetanol (β-ME 5% (v/v)), ditiotireitol (DTT, 10 milimolar) veya ditioeritiritol (DTE, 10 millimolar) gibi indirgen tioller numune tamponuna eklenir. Oda sıcaklığında soğutma sonrasında numune daha önceden elektroforez tamponuna batırılmış jeldeki ceplere yüklenir

Numunelere ek markır yüklenir. Bu metod ± 10% yanılma payına sahiptir) ^[6]

Elektroforez

Jel boyama

Coomassie-boyalı 10% Tris/Tricine Jel. Sol şeritte moleküler kütleyi belirleyen marker mevcuttur. Kalan şeritlerde saflaştırılmış maya proteinlerinde ayrılma gerçekleşmektedir.

^[7]^[8]

^[9]

Tarihi

^[1]

Dış bağlantılar

OpenWetWare: protocol for BisTris SDS-PAGE

Kaynakça

^ ^a ^b Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4". Nature. 227 (5259). ss. 680–685. doi:10.1038/227680a0. ISSN 0028-0836. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)
^ Neue Zürcher Zeitung: Interview with Ulrich Lämmli in German.
^ Reynolds JA, Charles Tanford (1970). "Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible implications for the state of proteins in biological membranes.". Proc Natl Acad Sci U S A 66 (3): 1002–7. DOI:10.1073/pnas.66.3.1002. PMC 283150. PMID 5269225. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=283150.
^ Smith, B. J. (1984). "SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins". Cilt 1. ss. 41–56. doi:10.1385/0-89603-062-8:41. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)
^ Staikos, Georgios; Dondos, Anastasios (2009). "Study of the sodium dodecyl sulphate–protein complexes: evidence of their wormlike conformation by treating them as random coil polymers". Colloid and Polymer Science. 287 (8). ss. 1001–1004. doi:10.1007/s00396-009-2059-3. ISSN 0303-402X. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)
^ Ian M. Rosenberg (22 December 2006). Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques. Springer Science & Business Media. ss. 103–. ISBN 978-0-8176-4412-3. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISBN= ve |isbn= kullanıldı (yardım)
^ Ladner CL, Yang J, Turner RJ, Edwards RA (2004). "Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining". Anal Biochem. 326 (1). ss. 13–20. doi:10.1016/j.ab.2003.10.047. PMID 14769330. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmid= ve |PMID= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)
^ Gilda JE, Gomes AV (2013). "Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots". Anal Biochem. 440 (2). ss. 186–8. doi:10.1016/j.ab.2013.05.027. PMC 3809032 $2. PMID 23747530. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmc= ve |PMC= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmid= ve |PMID= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)
^ Guan, Yihong; Zhu, Qinfang; Huang, Delai; Zhao, Shuyi; Jan Lo, Li; Peng, Jinrong (2015). "An equation to estimate the difference between theoretically predicted and SDS PAGE-displayed molecular weights for an acidic peptide". Scientific Reports. 5 (1). doi:10.1038/srep13370. ISSN 2045-2322. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[Laemmli1970-1] Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4". Nature. 227 (5259). ss. 680–685. doi:10.1038/227680a0. ISSN 0028-0836. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[2] Neue Zürcher Zeitung: Interview with Ulrich Lämmli in German.

[Reynolds-3] Reynolds JA, Charles Tanford (1970). "Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible implications for the state of proteins in biological membranes.". Proc Natl Acad Sci U S A 66 (3): 1002–7. DOI:10.1073/pnas.66.3.1002. PMC 283150. PMID 5269225. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=283150.

[Smith1984-4] Smith, B. J. (1984). "SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins". Cilt 1. ss. 41–56. doi:10.1385/0-89603-062-8:41. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[StaikosDondos2009-5] Staikos, Georgios; Dondos, Anastasios (2009). "Study of the sodium dodecyl sulphate–protein complexes: evidence of their wormlike conformation by treating them as random coil polymers". Colloid and Polymer Science. 287 (8). ss. 1001–1004. doi:10.1007/s00396-009-2059-3. ISSN 0303-402X. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[Rosenberg2006-6] Ian M. Rosenberg (22 December 2006). Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques. Springer Science & Business Media. ss. 103–. ISBN 978-0-8176-4412-3. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISBN= ve |isbn= kullanıldı (yardım)

[Ladner-7] Ladner CL, Yang J, Turner RJ, Edwards RA (2004). "Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining". Anal Biochem. 326 (1). ss. 13–20. doi:10.1016/j.ab.2003.10.047. PMID 14769330. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmid= ve |PMID= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[Gilda-8] Gilda JE, Gomes AV (2013). "Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots". Anal Biochem. 440 (2). ss. 186–8. doi:10.1016/j.ab.2013.05.027. PMC 3809032 $2. PMID 23747530. Birden fazla |author= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmc= ve |PMC= kullanıldı (yardım); Birden fazla |pmid= ve |PMID= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[GuanZhu2015-9] Guan, Yihong; Zhu, Qinfang; Huang, Delai; Zhao, Shuyi; Jan Lo, Li; Peng, Jinrong (2015). "An equation to estimate the difference between theoretically predicted and SDS PAGE-displayed molecular weights for an acidic peptide". Scientific Reports. 5 (1). doi:10.1038/srep13370. ISSN 2045-2322. Birden fazla |last1= ve |last= kullanıldı (yardım); Birden fazla |first1= ve |first= kullanıldı (yardım); Birden fazla |ISSN= ve |issn= kullanıldı (yardım); Birden fazla |DOI= ve |doi= kullanıldı (yardım)

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]