Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC yaygın adıyla bilinir) bir analitik kimya yöntemidir. Karısımlardaki bilensenlerin, ayrıştırılmasında, nitelik ve nicelliklerinin belirlenmesinde kullanılan bir analiz tekniğidir. Bu teknikte pompalar ile pompalanan yuksek basincli sıvı faz aracılığıyla taşınan analitler, kromatografik kolona ulaşır. Kolona ulaşan analitler, kolon ile farkli sekillerde etkileşip, farklı zamanlada detektöre ulaşırlar. Burda, kolon katı bir adsorbent maddeyle doludur ki, bu maddenin özellikleri sayesinde kromatografik ayrışma gerçekleşir.

Modern HPLC cihazi.

HPLC üretim alanında (örneğin farmosetik ve biyolojik ürenlerin üretiminde), adli durumlarda (idrar tahlili vasıtasıyla performans artırıcı madde veya uyusturucu bulgularında), araştırma alanında (örneğin kompleks biyolojik örneklerin ayrıştırlmasında veya sentetik kimyasalların ayristirilmasinda) ve tıbbi alanda (örneğin kan serumunda D vitamini tayininde) kullanılır.

Kromatografi, tanımına bakıldığında adsorpsiyon içeren bir kütle transfer prosesi olarak düşünülebilir. HPLC de önceden bahsedildiği gibi, pompalarla örneklerin bir kolona gönderilip ayrıştırilması hususuna dayanır. Kromatografik kolonun aktif bileşeni (adsorbent) genellikle granüler yapıda olan, katı partiküllü (silicon veya polimerik yapıda olabilir) bir maddedir. Bu partiküller 2–50 μm boyutundadır. Kolona gelene karışımın bileşenleri bu partiküllerle olan farklı derecedeki kimyasal veya fiziksel etkilesimden dolayı birbirinden ayrılırlar. Bu karışımları taşıyan sıvılar genellikle yüksek basınç altındadırlar ve genelde bir kaç solventin (çözgen) bileşiminden oluşurlar. Bu çözgenler genel olarak su asetonitril, metanoldur. Analitleri taşıyan bu sıvıya sıvı faz denir. Sıvı fazin (veya likit faz) genel bileşimi (yani hangi solventlerden oluştuğu) ve sıcaklığı analitlerin ayrışma prosesinde önemli bir rol oynar. Bunun sebebi ise bu faktörlerin analit ve kolon (adsorbent) arasındaki etkileşimi direkt olarak etkilemesidir. Bu etkileşimler genellikle fiziksel etkileşimlerdir ve örnek vermek gerekirse hidrofobik (dispersif), dipol-dipol ve iyonik, genellikle bunların bileşimi şeklinde olabilir.

HPLC geleneksel (düşük basınçlı) sıvı kromatografisinden ayrılır. Bunun en önemli sebebi ise kullanılan basınç değelerinin çiddi bir derecede fazla olmasıdır (50-350 bar). Geleneksel kromatografi genelllikle yerçekimi gibi çok düşük basınç kullanırken, HPLC bahsedildiği gibi çok yüksek basınçlarda işlem yapar. HPLC'de ayrıştırılan madde miktarı çok düşük olduğu için, tipik kolon boyutları 2.1-4.6 mm çap, 20-250 mm uzunluğundadır. Ek olarak, HPLC kolonlarında kullanılan partiküllerin büyüklüğü genel olarak 2-50 μm arasındadır. Bu partikül boyutları HPLC'yi etkili ve populer bir kimyasal ayrıştırma ya da analiz teknigi olmasını sağlar.

HPLC cihazları tipik olarak degasser, enjektör, pompa, kolon ve detektörden oluşur. Enjektörün örnek karışımını (numuneyi) mobil faza enjekte etmesiyle, analitler kolona taşınır. Kolon da icindeki sabit faz yardimiyla bu analitleri ayrıştırarak detektöre gönderir. Detektöre gelen analitler de miktarlarına ve hatta özelliklere göre sinyaller üretir. Bu sinyaller de mikroprosesörler ve veri analizi programlarıyla analizlenir. Bu veri analizi sayesinde kalitatif ve kantitatif analiz tamamlanmış olur. Modern kromatograflarda, pompalar değişik oranlardaki solventleri, zamana da bagli olarak karıştırıp mobil fazlar üretebilir. Detektör olarak da genellikle UV/Vis detektörü, fotodiyot detektörü (PDA) veya kütle spektrometresi kullanılır. Çoğu HPLC cihazlarında, kolonun bulunduğu bir kolon bölümü (kolon fırını veya kolon kompartmanı da denir) bulunur ve bu bölüm kolon sıcaklığını değiştirerek, analitler ile kolonun içindeki sabit fazın etkileşimini etkiler. Bu etkileşim farklılaşması sayesinde analitlerin ayrışması sağlanır.

Çalışma Prensibi

Ayrışacak veya analizlenecek numune, cihaza çok küçük hacimlerde (tipik olarak mikrolitre seviyesinde) kromatograftaki mobil faz akışına verilir. Akan mobil faz, bu maddeleri kolona taşır. Numunenin içindeki analitler turlerine gore farkli hizlarda hareket ederler ve bu hız farkının belirlenmesinde sabit faz-analit etkileşimi (fiziksel etkileşimler) önemli bir rol oynar. Analitlerin taşınma hızı, analitlerin kimyasal doğasına, sabit fazın (kolon) kimyasal yapısına ve de mobil fazın bileşimine bağlıdır. Analitin kolondan çıkma süresine alıkonma zamanı (genelde RT ile gösterilir) denir. Alıkonma zamanı genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanılan önemli bir bilgidir.

Çok çeşitli HPLC kolonları piyasada mevcuttur. Bir HPLC kolonun niteliğini bir takım özellikleri belirler ve bu özelliklerden en önemlisi sabit fazının kimyasal yapısı, bir başka deyişle bu sabit fazi oluşturan partiküllerin türü ve büyüklüğüdür. HPLC kolonlarında partiküllerin boyutunun küçük olması kolondan gelen geri basıncı (ing. backpressure) artırır,. Kısacası partikul boyutunun düşmesi, geri basıncı da doğru orantılı olarak artırır. Tipik olarak, kolondaki küçük boyutlu partiküller, yüzey alanını artırdığından beraberinde analitlerin daha etkili bir biçimde ayrılşmasını (resolusyon) sağlar. Resolüsyon, kromatografide elde edilen ardışık analit piklerinin ayrışma derecesi olarak tanımlanabilir. Ek olarak, bu sorbent partikülleri hidrofobik veya polar olabilir.

Mobil fazlar incelendiğinde, genel olarak su ve suyla çözünebilen organik bir solvent kullanılır. Bu solventlerden de en yaygın olarak kullanılanları metanol ve asetonitrildir. Bazı HPLC teknikleri içinde suyun bulunnmadığı mobil fazlar da kullanılır (Normal faz sıvı kormatografisi). Genellikle mobil fazın içerisinde formik asit, fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazı tuzlar da eklenir. Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna, yani analitlerin ayrışmasına yardımcı olur. Mobil fazın bileşimi analiz sırasınca sabit tutulabilir ve bu işleme isokratik elüsyon denir. Mobil faz bleşminin zamana bağlı değiştiği analizlere de gradiyent elüsyon denir. İsokratik analizler genellikle kimyasal özellikleri tamamen farklı veya sabit faza farklı derecelerde ilgi gösteren molekkülerin bulunduğu karışımları ayırmada kullanılır. Gradiyent analizlerde analitlerden elüsyon kuvveti az olandan çok olana doğru bir moleküler ayrışma gözlenir. Bi başka deyişle, analitler sabit faza yüksek afinite gösterdiklerinde, sabit fazla daha çok etkileşirler ve kolon içersinde daha çok zaman geçirerek detektöre daha geç ulaşırlar, fakat bazı analitler de sabit fazla fazla etkileşmez ve daha hızlı bir biçimde detektöre ulaşırlar. Bu farklılık, farklı zamanlarda sinyallere neden olur be bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri, kromatogramda farklı zamanlarda çıkar. Tipik bir ters faz kromatografi gradiyent analiz %5 asetonitrile ile başlarve doğrusal olarak 5-25 dakika içerisinde, %95'e kadar çıkar. Mobil fazın bileşimin değsımediği periyotlar da analiz profilinde yer alabilir. Örneğin, mobil faz 1-3 dakika boyunca %5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra doğrusal olarak ilerleyen dakikalarda %95'e çıkabilir.

HPLC sisteminden cıkan maddelerin toplandıgı bir düzenek.

Bu hususta, mobil fazın bileşiminin belirlenmesinde, mobil faz analit etkileşimi ve analit sabit faz (kolon) etkileşimleri göz önünde bulundurulur. Örneğin ters faz HPLC'de hidrofobik etkileşimler görülür. Analitlerin mobil faz ve sabit faza olan ilgisi (affınıtiesi) ve farklı analitlerin farklı derecelerde olan etkileşimleri sonucunda kromatografik ayrışma gerçekleşir. Bir başka deyişle, analitlerin sabit faz ve mobil fazdaki partitisyonu kromatografik ayrışmada önemli rol oynar. Sıvı-sıvı ekstraksiyonunda da benzer prensip görülse de HPLC de bu işlem süreklidir, ekstraksiyonda ise adımlar şeklindedir. HPLC örneğinde, su/asetonitril mobil fazi kullanıldığında, hidrofobisitesi yüksek olan analitler kolondan daha geç ayrılacaklardır. Bunun sebebi ise, gradiyen bir metod kullanıldığı var sayıldığında, mobil fazdaki asetonitril miktarı zamanla artacaktır ve sonucunda da analitler kolonla daha çok etkileşeceklerdir. Mobil faz bileşenlerininin belirlenmesi, eklenmesi gereken tuz ve asitlerin secilmesi, kolon seçimi, gradiyent zamanlarinin belirlenmesi analizlerden önce dikkatle belirlenir ve bu aşamaya metod geliştirme denir.

Tarihsel Gelişimi

Bilim adamları, HPLC'den önce genel olarak standart sıvı kromatografisi tekniklerini kullanmaktaydı. Fakat sıvı kromatografisi, mobil fazın akış hızının yer çekimine bagli olmasından dolayı yeterince verimli değildi. Kimyasal ayrışmalar kimi zaman saatler hatta günler sürmekteydi. Gaz kromatografisi (GC) her ne kadar o günlerde sıvı kromatografisinden daha etkili olsa da, gaz fazındaki ayrışmaların ve yüksek molekül ağırlıklı polar molekullerin analizinin imkansız olduğu düşünülmekteydi. GC biyokimyacılar için de yeterince etkili değildi ve bunun nedeni de, analizlenmek istenen moleküllerin termal kararlığa sahip olmamasıydı. Sonuç olarak, alternatif analiz yöntemleri ortaya sürüldü ve bu çalışmalar HPLC'nin gelişmesi ile sonuçlandı.

1941'de Martin ve Synge'in sıvı kromatografisi üzerine yaptığı çalışmalar genel olarak bu konudaki ilerleyen yıllardaki çalışmalara öncülük etmiştir. 60'li yıllarda Cal Giddings, Josef Huber, ve diğer bilim adamları sıvı kromatografisinin, kolonlardaki partikül boyutunun küçülmesiyle çok daha etkili bir ve yüksek verimli bir biçimde çalışacağını öngördü. Burda bahsi geçen partiküller genel olarak 150 μm boyutundaydi ve bu partiküllerin küçülmesi ayni zamanda mobil fazın partiküller arasından akıp geçmesi için gerekli olan basıncı da kayda değer bir biçimde yükseltecekti. Bu tahminlere bağlı olarak, bilim adamları 60'li ve 70'li yillarin basinda bu konuları cok sayida deneyler ile test edip bazı sonuçlara ulaştılar. Bunu sonucunda da, bahsi geçen büyük partiküllerin küçültülmesi amacıyla yeni partiküller geliştirilmeye başlandı. Zipax adında yapay olarak porlu partiküllerin HPLC kolon teknolijisi için gelecek vaadeden bir buluş olduğu sonucuna varıldı.

1970'lerde HPLC donanımı ve enstrumentasyonu alanında bir çok gelişme yaşandı. Araştırmacılar pompa ve enjektörler kullanrak ilk HPLC dizaynını tasarlayıp hayata geçirdiler. Gaz kullanarak yüksek basınca ulaşabilen pompalar kullanılan ilk pompalardandı. Bu tarz pompların ideal olmainin sebebi de sabit bir mobil faz akışı saglayıp ve verimli derecede nicel analizde kullanilmasi için, sabit basınçta çalışabilmeleri, sızıntı yapmayan conta gereksinimine ihtiyaç duymaması gösterilebilir. Dupont (Endüstriyel Polimerler Bölümü) septumlu enjektör kısmını, sabit hacimli bir hazneye sahip bir enjeksiyon vanasıyla değiştirerek, daha verimli bir cihaz geliştirdi. Bu cihazda bekleme zamanı, yani hazırlanan mobil fazın kolona ulaşma zamanı (dwell) düşüktür ve bu nicel analizde önemli bir avantajdır.

Her ne kadar donanımsal gelişmeler çok önemli olsa da, HPLC'nin gelişimi genel olarak kolonlardaki kullanılan partiküllerin gelişimi ve evrimi etrafında şekillenmiştir. Bu konuda kolon, kimyasal ayrışmanın yer aldığı ünite olduğundan, bazen kromatografın kalbi olarak da bahsedilebilir. Sonuç olarak kolon da bir takım partiküllerden oluştuğu için, bu araştırmalar HPLC'nin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. Porlu partiküllerin keşfinden sonra, bu partiküllerin boyutunu düşürmek için ciddi bir çaba harcanmış ve bu araştırmalar uzun süre devam etmiştir ve hatta gunumuzde de devam etmektedir. Fakat, bu partikül boyutlarının küçülmesi yanında bir takım sorunlari da getirmiştir. Bu sorunlardan birisi, mobil fazın basıncındaki oluşan dalgalanmalar, ani basınç düşmeleridir ki sabit basınç HPLC'de önemli bir parametre olarak gösterilir. Diğer bir problem de bu mataryellerin kolona tekdüze ve homojen bir biçimde yerleştirilmesinin zor olmasıdır. Genellikle, ne zaman partikül boyutlari ciddi bir bicimde düşürülse, buna uygun olan cihaz parçaları gelistirilir ve bunun en önemli sebebi de yüksek basınç gereksinimleridir.

HPLC Türleri

Partisyon kromatografisi (HILIC)

Partisyon kromatografisi, kimyagerlerin geliştirdiği ilk kromatografi türlerinden biriydi. Partisyon katsayısı prensibi, kağıt kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, gaz fazı ve sıvı-sıvı ayırma uygulamalarında uygulanmıştır. 1952 Nobel kimya ödülü amino asitleri ayırmak için kullanılan tekniği geliştirdikleri için Archer John Porter Martin ve Richard Laurence Millington Synge tarafından kazanıldı. Partisyon kromatografisinde, kağıt kromatografisinde olduğu gibi bir "inert" katı destekleyici matrisin yüzeyinde veya taneleri veya lifleri içinde tutulan bir çözücü kullanılır; veya sabit faz ile bazı kulombik ve / veya proton verici etkileşimlerinden yararlanır. Tıpkı hidrofilik etkileşim kromatografisinde (HILIC; HPLC içinde bir alt teknik) olduğu gibi, bu yöntem, analitleri polaritelerindeki farklılıklara göre ayırır. HILIC'de çoğunlukla güçlü bir bileşen olarak bağlı bir polar sabit faz ve genel olarak su ile asetonitrilden yapılmış bir mobil faz kullanır. Partisyon kromatografisi, geçmişte bağlı olmayan silika veya alümina desteklerde kullanılmıştır. HILIC, sabit fazları (kolonları), asidik, bazik ve nötr çözünenleri tek bir kromatografik çalışmada ayırma avantajına sahiptir.

Kaynaklar

İnglizce Vikipedi HPLC maddesinden çeviri (Son ulaşım 13 Nisan 2020)